【#第一文档网# 导语】以下是®第一文档网的小编为您整理的《转基因技术在鸡的抗病育种中的研究应用进展》，欢迎阅读！
转基因技术在鸡的抗病育种中的研究应用进展 来，禽病是困扰养禽业发展的关键问题之一。目前我国禽病就有80余种，其中传染病占75％左右，每年造成的经是2003年末东南亚地区暴发的由H5N1亚型禽流感病毒引起的高致病性禽流感，导致上亿只禽类死亡或被扑杀，且况。目前尽管免疫接种、扑杀、药物治疗等传统的禽病防治方法已取得了不错的效果，但并非对所有疾病有效或完方法从遗传素质上提高鸡对病原的抗性，进行抗病育种，是禽病防治的有效途径之一。 育种遗传的选择途径 遗传的选择途径很多，但一般可分为两大类，一类是直接选择方法，包括：①观察种畜禽；②攻击种畜禽；③攻击④攻击克隆。另一类是间接选择方法，包括：①疫苗接种；②体外试验；③遗传标记；④通过分子遗传学方法寻找转基因技术的方法分类及在鸡抗病育种中的应用 术属于分子遗传学中一种极具潜力的抗病育种途径，它是指将已知的外源基因移人动物细胞并整合到基因组中，从。自Palmiter等于1982年首次成功获得转基因“超级小鼠”后，转基因技术先后在牛、羊、猪、兔、鸡等动物上点是能够实现基因的种间转移，因此不同来源的基因具有增强抗某种特定疾病的能力，用于动物的抗病育种可提高种进程。随着胚胎学、分子生物学等学科的飞速发展，如今这项技术在增强动物抗病性方面显示出了诱人的应用前基因方法及其抗病育种效果 抗性基因转移的方法主要有：显微注射法、反转录病毒载体法、精子载体法、胚胎干细胞法；原生殖细胞介导法 显微注射法：显微注射法操作方法是将外源DNA直接注入到动物的卵中，此方法在哺乳动物及鱼类的研究中已精卵结构和胚胎发育过程比较特殊，利用此法对其受精卵进行遗传操作具有相当大的难度，使得该方法早期在鸡的约。后来经过许多学者对这方面技术的不断研究，最终取得了一些重大的突破，如Perry等(1988)、Naito等(19后建立和完善了鸡受精卵体外发育的培养系统，使鸡胚的显微注射及其发育成为可能；Jemie等(1993)将带有目的精卵胚胎中，体外培养12h后发现有50％的存活，且胚胎含有质粒DNA。Thanaka等(1994)设计了鸡的体外受精和短了体外培养时间，并为显微注射法奠定了更好的基础。李赞东等(1997)用这一方法将质脂体包装后的质粒PMi胚期胚盘中，转基因也获得成功，并证明在囊胚期注射外源基因可以获得转染的原生殖细胞(PGC)，并能遗传给下研究表明显微注射法在禽类是一个有效的转基因途径。其不足之处就是需杀鸡取卵，不便于商业推广。要解决此问化和胚胎体外培养及移植技术的进一步完善。 转录病毒载体导入法：目前这一方法是鸡的转基因最常用也是最有效的方法，其基本原理是当反转录病毒的RNA进，依靠反转录病毒的整合酶及其末端特异的核苷酸序列，DNA可以整合到染色体上，从而将其所携带的外源基因插具有整合率高且技术难度不高，成本低等优点。目前使用的反转录病毒载体有两类：复制完全型和复制缺陷型载体型病毒载体有禽白血病病毒(ALV)和罗斯肉瘤病毒(RSV)。Garber等(1991)将 Mxl基因转至鸡细胞中，使鸡获得了对den等 f1992)利用病原介导抗性，将重组 ALV基因转至鸡体内，用小白鼠 Mx基因可诱导生成干扰素，可干扰O防止病毒性流感。复制缺陷型载体即将病毒基因编码区去掉，使之成为不能编码病毒的结构蛋白，造成复制缺陷以。近年来已构建的禽类复制缺陷型载体有ALV、网状组织增生病毒(REV)和脾坏死病毒(SHV)等， Bosselman等(19基因和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因的网状内皮组织增生病毒(复制缺陷型)为载体获得了转基因鸡。2004年，韩国学的绿色荧光蛋白(GFP)基因导入鸡细胞得到转基因荧光鸡。其不足之处就是外源基因的大小受到反转录病毒颗粒大h，另外反转录病毒介导的转基因会影响外源基因的表达。不过，随着学科的不断发展，这些不足将会被逐步克服抗病育种中的广泛应用。 3．1．3精子载体法：早在1971年， Brackett等用兔精子和3H_胸腺嘧啶标记的SV40DNA共温育后，经研究发现外源DNA在受精过程中被携带进入卵细胞内。1989年， Lavitrano等首次利用小鼠附睾精子与DNA温育产生转基因小鼠，转基因效率高达30％，外源基因稳定整合到生殖细胞中，由此获得了转基因株系。上述结果引起了广大科研工作者的极大兴趣，以精子为载体的，针对不同动物品种的研究工作相继展开。精子携带DNA主要通过3种途径来完成，即将外源 DNA与精子共同孵育、电穿孔导入法和脂质体转染法。相对而言电穿孔能够增加鸡精子吸附DNA的效率，但在提高转基鸡产生效率上远不如脂质体介导。 用这种方法进行鸡的抗病育种方面的报道有：Rottmann等(1992)将载有小鼠H2-K启动子及编码B型肝炎表面抗原基因的质粒用脂质体包装后，与鸡精子共同孵育。但经分析发现，外源DNA没有完全整合到鸡胚染色体中，而是呈游离形式存在。Squires等(1993)根据前人的经验，把DNA用不同的脂质体包装后与鸡精子共同孵育，结果发现脂质体能把外源 DNA转化到精子细胞内，且不损害精子的受精能力。徐少甫等利用这一技术将马立克氏病病毒(MDV)的38 ku磷蛋白基因转移到鸡的基因组内，整合率为5％。 尽管精子载体法还存在一些如稳定性较差等问题，但相对显微注射、反转录病毒法而言，此法存在不少优势。反转录病毒载体法既要重组反转录病毒，又要用显微操作技术，显微注射法所用注射针很细(约0．78pLm)，故不能操作大片段外源基因的重组体，而精子载体法的注射针的直径是其100倍(约781xm)。另外有些动物的合子含丰富的脂肪，不易观察，而该法则没有这一问题，而且简便、经济，因此随着精子与外源DNA的相互作用及其DNA在卵内变化的分子机制的进一步研究，该法在鸡大批量抗病育种方面有广泛的应用前景。 3．1．4胚胎干细胞(ES细胞)法： ES细胞是从早期胚胎的内细胞团(ICM)或原始生殖细胞fPGC)分离出来的具有发育全能性的一种未分化的细胞。它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。ES细胞的成功分离最早是在小鼠中取得的。1981年Evans和Kaufman分别建立了一种分离多能干细胞的方法，首次获得ES细胞。胚胎干细胞注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，因此可以将其作为一种载体，导入外源基因，获得转基因动物。 在家禽抗病育种上，通过克隆特定病毒基因组中的某些编码片段，对其进行一定修饰后转人家禽基因组，如果转基因在宿主基因组中能够表达，那么畜禽对该病毒的感染应具有一定的抵抗能力。Perry等(1990)将芦花鸡第五期胚胎分层细胞注入白来航鸡胚的囊胚层内，获得了嵌合体。Yamashita等(1995)将克隆的小鼠Mx基因有意义链和反意义链插入禽反转录病毒载体中，并以之转染鸡胚胎成纤维细胞(CEF)，结果表明，插入有意义链反转录病毒载体转染的(CEF）对人流感病毒、禽流感病毒的感染具有抵抗作用。这一方法的缺点就是ES细胞比较难建立，且产生的转基因鸡是嵌合体。因而它在鸡抗病育种中的应用不是太多，要完善这一方法，关键就是要建立 ES细胞培养系统。 3．1．5原生殖细胞介导法：原生殖细胞(PGC)介导的转基因技术在原理和方法上与ES细胞技术相似，应用PGC技术在家禽转基因方面有明显的优势。PGC就是指将发育为生殖细胞的细胞，即生殖细胞前体。它位于早期胚胎的胚芽区内或血液中，胚胎循环系统开始发育时随血液迁移到生殖脊，在生殖脊定居后，便增殖分化为生殖细胞。该方法的基本原理就是先从血液或胚芽区内分离PGC，然后进行体外培养和外源基因导入等处理，再将其注射入早期胚胎中，这样 PGC就可搀入胚体，参与胚胎的发育，成为胚胎性腺的一部分。而性腺中的生殖细胞一旦携带外源基因就有可能世代遗传。外源基因的导入可直接进行转化，也可利用反转录病毒进行转染。此法的关键是 PGC的体外培养和基因导入后 PGC的定位吸收，该方法在禽的转基因研究中应用较多。JaiimR等早在1993年就通过转移来航鸡和洛岛红鸡PGC获得了嵌合体；Allioli等(1994)从发育5d的鸡胚中取出 PGC，用ALV感染得到了转基因鸡。 3．2使用转基因技术对鸡进行抗病育种的一些候选基因简介 转基因技术在鸡的抗病育种方面具有十分乐观的应用前景。目前这方面的研究涉及四类基因的转移，第一类是进化过程中天然发生的抗病基因，如主要组织相容性复合体(MHC)等位基因；第二是病毒衣壳蛋白基因；第三是人工合成基因如反义基因和核酶基因；第四是细胞因子及其受体的基因，例如干扰素(IFN)基因及IFN受体基因等。 3．2．1 MHC：MHC在鸡中又称为 B复合体，它是参与调节机体免疫反应的基因群，其中有多种单倍型与抗病性有关。在鸡MHC与疾病抗性关系方面，研究最多的是与马立克氏病(MD)的关系。现已鉴定出许多与MD抗性相关的基因，如 B21、B12单倍型对MD有抗性，而 B15、B19单倍型对MD敏感。目前，研究者以天然抗MD的鸡为对象来鉴定和分离抗MD基因，但在鸡 MD抗病转基因育种方面未见有成功例子报道。鸡对Rous肉瘤病(Rsl的抗性也与B复合体有关，B。单倍型表现出较强的抗性，而B5易感；有些则对RS抗性呈互补性，如B'W、B383对RS易感，而B183则表现出较强的抗性，杂合子 B∞B26也比纯合子B23 B23和B23 B26有更强的抗性。此外，鸡对淋巴白血病、禽霍乱及球虫病等的抗性也与MHC相关。可见MHC在利用转基因技术对鸡进行抗病育种方面有极大的研究价值。 3．2．2抗流感病毒基因：早在20世纪60年代，就有学者发现，具有 MX等位基因的小鼠对A型及B型流感具有天然的抵抗力。后来发现，MX基因存在于几乎所有真核生物中，只是以隐性等位基因的形式存在。1990年，Amheiter等将 Mxl蛋白的cDNA导入对流感病毒敏感的小鼠受精卵，获得了抗病转基因小鼠。Brem等(1988)将小鼠抗流感基因(Mx)转入了猪，使转基因猪增强了对流感病毒的抵抗能力。1991年，Garber等也利用小鼠 Mxl全长cDNA转染鸡成纤维细胞，结果转化细胞对鸡的流感病毒 A／Turkey／wisconsin／68 和 A／ Turkey／massachussetts／65复制均具有抑制作用。 3．2．3病毒衣壳蛋白基因：病毒衣壳蛋白基因在宿主体内整合、表达后。能阻止同一病毒再侵染。1989年Cfittenden等将A亚组禽白血病病毒(ALV)注人鸡蛋，发现其后代能抗同亚组病毒感染，并提出机理可能是特异性地干扰相同病毒的穿膜过程。 3．2．4反义核酸：反义核酸(反义 RNA)是存在于原核生物中的一种基因表达调控因子。它们可以通过碱基配对与特异性的mRNA结合，阻止mRNA的翻译。在真核细胞中也发现这样的小分子RNA，具有抑制或关闭mRNA翻译的功能。反义核酸抑制病毒复制的试验已先后在培养细胞和动物体内获得成功。如Munir等人已成功地在转基因鼠中表达了反义RNA；Ka． mamur等(19911用与马立克病 mRNA互补的一段寡核苷酸f反义 RNA)抑制转化淋巴细胞的增殖，因而将反义RNA片段转至鸡染色体中，使鸡获得抗病性。目前这一技术在抗病育种方面已取得较大的进展。它很可能成为控制病毒性疾病的一条重要途径。 3．2．5核酶：核酶是一类能终止基因表达的酶性小RNA分子，具有催化RNA切割反应的功能，可以序列特异性地切割RNA。因此，只要已知某种病毒的RNA序列，就可以设计并合成相应的抗病毒核酶。 3．2．6干扰素基因和干扰素受体基因：干扰素fIFN)是动物机体内可被多种诱导物诱导产生的生物活性蛋白。而IFN是通过与细胞的表面相应受体结合，诱导细胞产生抗病毒蛋白而实现抗病作用的，所以也可以通过增加机体细胞表面受体即干扰素受体的数量的途径，来充分发挥干扰素的间接抗病毒作用。鸡干扰素是最早发现的干扰素，但对它的研究却远远落后于哺乳动物和人。直到1994年， SekeIlick才首先克隆到鸡的α干扰素基因。1995年，Digby首次克隆到鸡的γ干扰素基因。据报道，近年来新疆玛纳斯县兽医站用鸡干扰素对鸡的主要病毒性疾病，如鸡新城疫、传染性支气管炎及马立克氏病等进行预防和治疗时，取得了良好的效果。 另外，比较有价值的候选基因还有病毒中和性单克隆抗体基因，这一基因的研究目前已初有成效。当然很多情况下可以将以上基因中几个联合应用，比如将反义 RNA基因和核酶基因融合在一起，既可阻断病毒RNA的翻译，又可将病毒RNA切断，从而大大增强其抗病毒作用。 目前，利用转基因技术进行鸡的抗病育种，不仅在基因的导入技术、外源基因的选择与表达等方面尚需进行大量探索性工作，而且由于导入外源基因改变物种，还需面临很多生态学和伦理学方面的问题，但随着转基因理论和实验技术的不断完善以及抗病育种潜在的巨大经济效应，相信在不远的将来，转基因技术定会给鸡的抗病育种带来巨大的变革 本文来源：https://www.dywdw.cn/ebd54f66783e0912a2162afa.html
下载此文档
搜索文档
阅读：
文档下载
2022-08-10
