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植物5脂氧合酶（5-LOX）ELISA试剂盒说明书仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物5脂氧合酶(5-LOX)活性。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物5脂氧合酶(5-LOX)水平。用纯化的植物5脂氧合酶(5-LOX)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物5脂氧合酶(5-LOX)，再与HRP标记的5脂氧合酶(5-LOX)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的5脂氧合酶(5-LOX)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物5脂氧合酶(5-LOX)浓度。 标本要求： 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为180 IU/L，120 IU/L，60 IU/L，30 IU/L ，15IU/L）。 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 温育：操作同3。 洗涤：操作同5。 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。 注意事项： 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 底物请避光保存。 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。 计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。 试剂盒性能： 1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。 2.批内与批见应分别小于9%和15% 检测范围： 6 IU/L -180 IU/L 保存条件及有效期： 1.试剂盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6个月 本文来源：https://www.dywdw.cn/8a6f2c2ea02d7375a417866fb84ae45c3b35c236.html
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2022-06-18
