甲基化检测方法

2022-07-07 15:56:27 第一文档网 [ 字体：小中大 ] [

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甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)

第一部分基因组DNA的提取。

这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节:

1:蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml;

2:RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。验证提取DNA的纯度的方法有二:

1:紫外分光光度计计算OD比值;

2:1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰。

第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

如不特别指出,所用双蒸水(DDW)均经高压蒸汽灭菌。

1:将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul;

2:加5.5ul新鲜配制的3M NaOH;

3:42℃水浴30min;

水浴期间配制:

4:10mM对苯二酚(氢醌),加30ul至上述水浴后混合液中;(溶液变成淡黄色)

5:3.6M亚硫酸氢钠(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6:EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液。

7:加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化。

8:50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适。

这一步细节:

1:基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug。

2:所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确。

3:亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

4:水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全。

第三部分修饰后DNA纯化回收

EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。

1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。

2:以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统(Promega,A7280)

1)70℃水浴预热DDW;配制80%异丙醇;

2)加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合;

3)由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便;如果没有,需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积。

4)将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80%的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。

5)将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上,离心

12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥。此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态。

6)将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min。

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